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细胞系预实验-MOI 的确定

发布日期:2016-11-22字号调整14px浏览次数(303)
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      预实验的目的是了解所操作细胞被慢病毒载体感染的容易程度,另一方面在一些情况下虽然慢病毒已经感染进入细胞,但由于表达标记基因的启动子在该细胞内的表达效率不高,没能观察到感染现象。我们在预实验方案中加入不同启动子的病毒进行感染,并且用定量PCR测定感染后细胞内整合病毒,这样即使病毒没有表达也可以观察感染。

    1. 感染前一天接种,使得第二天细胞汇合度为30-40%。培养板可以是96孔板(只通过显微镜观察荧光)或是24孔板(通过流式或是定量PCR确定感染比例)。

    2. 设置不同MOI值的感染组,通常设立1,2,5,10,20,50,100的感染组别,各做两个孔,一个孔中加入终浓度为5 μg/ml的polybrene,另一组不加。Polybrene可以促进病毒对细胞的侵染,但在少数情况下它对细胞有伤害。常用的对照病毒包括CMV-GFP,EF1a-GFP,UbiC-GFP,PGK-GFP。一般细胞里面CMV启动子的表达活性是最强的,但在血液来源的一些癌细胞中EF1a的表现要优于CMV。UbiC在一般细胞中都表达,但表达活性一般要低一些,它在神经元等原代细胞的感染中是最好的。

    3. 12-24小时后,将培养上清丢掉同时除去没有感染细胞的病毒,更换为新鲜的培养基。

    4. 感染3-4天后可以在荧光显微镜下观察,细胞应当会被感染并表达荧光。细胞感染的比例可以通过拍照目测估计或是根据图片数数计算。

    5. 如果是用24孔板做的预实验,则可以用消化液将细胞消化成单个,通过流式细胞法得到每个感染复数下被感染细胞比例,此时注意设置空细胞组用于对照。

   6. 也可以将消化下来的细胞抽提基因组DNA,用滴度测定中介绍的定量PCR方法得到整合病毒和细胞的比例。注意如果是所感染为动物细胞则需要用相应物种的内参基因。

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