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未经TKI治疗的EGFR敏感突变NSCLC患者的高T790M突变率:真阳还是假阳?

发布日期:2016-12-19字号调整14px浏览次数(474)
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EGFR敏感突变NSCLC患者终会产生获得性耐药,而50%获得性耐药是由于T790M突变引起的。早期研究显示,大约2%未经TKI治疗的NSCLC中也检测到T790M突变。近期,三个研究组发现,通过使用高灵敏度检测方法,在40%未经TKI治疗的NSCLC中检测到了T790M突变。仔细研究这些报道,我们发现,所有这些数据均来源于FFPE标本。于是,我们不禁怀疑这么高的阳性突变率是否由福尔马林固定所致。为解答这个问题,我们研究了36FFPE和冰冻组织标本,标本来源于未经TKI治疗、携带有EGFR敏感型突变的NSCLC患者。采用以限制性内切酶为基础的突变富集聚合酶链式反应法(ME-PCR),其灵敏度为0.1%。另外,也检测了冰冻组织和癌旁正常组织FFPE标本,以进行后期比较研究。我们发现,FFPE标本T790M突变阳性率为41.7%(15/36),与文献报道一致,但对应的冰冻标本中,T790M突变阳性率仅为2.8%1/36)。癌旁组织T790M突变率,在FFPE标本为48.5%16/33),而35例冰冻组织无一阳性,进一步验证了我们的假说。我们的结果提示,在未经TKI治疗的NSCLC患者中,应用高灵敏度方法检测到较高的T790M阳性率,在一些患者中可能是FFPE标本处理导致的假阳性。

 

较早的文献用测序法在约2%未经TKI治疗的EGFR敏感突变NSCLC患者中检测到了T790M突变。随着高灵敏度检测技术的应用,三个研究组分别发现约40%T790M突变出现在未经TKI治疗的EGFR敏感突变NSCLC患者中,远高于传统方法检测的结果。Su et al. 等用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(灵敏度1.5%)检测NSCLC患者中T790M突变率,并用二代测序(灵敏度3.7%)验证,检测结果为在未经TKI治疗的EGFR敏感突变NSCLC患者中T790M突变率为41%23/56)。Rosell et al. 等将PNATaqMan方法结合起来(灵敏度0.02%)在EGFR敏感突变的两组NSCLC患者中同时检测T790M突变率,结果分别为35%45/129)和38%30/78)。该结果未使用第二种灵敏方法做进一步验证。Maheswaran等用Scorpion ARMS法(灵敏度0.2%)在未经TKI治疗的EGFR敏感突变NSCLC患者中检测到T790M突变阳性率为38%10/26)。但重要的是,其他研究组用同样方法分析了类似的标本集,并未报到出如此高的T790M突变率。总体上,这三个研究用高灵敏度方法(3.71%-0.02%),检测到在未经TKI治疗的EGFR敏感突变NSCLC患者有约40% T790M突变阳性率。

 

然而,我们分析这三个研究的共性时发现,三个研究均使用是福尔马林固定样品检测T790M,而且在某些研究中新发展出来的方法仅在没有固定处理的细胞系中验证、而未在FFPE标本中验证。考虑到以往报道过高灵敏度的检测方法和缺乏验证将导致福尔马林固定的样品中检测到假阳性的基因突变率。因此,我们推测以上三个研究结果中高T790M阳性突变率有可能是福尔马林固定的结果。为了验证我们的推测,我们收集了36对来自未经TKI治疗的NSCLC肿瘤组织的冰冻标本和FFPE标本,以及部分癌旁正常肺部组织的成对冰冻和FFPE标本。其中肿瘤组织均携带敏感型EGFR突变,包括19-Del13/3636%)、L858R18/3650%)和其它突变类型(5/3614%)。Puregene DNA提取试剂盒和QIAamp DNA FFPE组织试剂盒分别提取冰冻标本和FFPE标本的DNA,使用灵敏度为0.1%的基于限制性内切酶ME-PCR法检测T790M

 

结果显示,肿瘤FFPE标本有41.7%15/36)的T790M阳性率,该结果与之前的报道相似。然而,36个对应的冰冻标本中仅1个(2.8%)是T790M阳性。更有意思的是,在癌旁正常组织样本中,48.5%16/33)的FFPE标本为T790M阳性,相应的冰冻标本则没有任何一例检测到T790M突变。如果仅考虑可重复的阳性结果,约20%T790M阳性率能同时在肿瘤和癌旁正常组织的FFPE样本中检测到。所以,本研究首次证实未经TKI治疗的NSCLC患者使用高灵敏度检测方法得到的高T790M阳性率可能是FFPE导致的假阳性。

 

Williams et al报道过福尔马林固定的标本较之冰冻标本有较高频率的序列改变。96%27/28)的假阳性突变是C-TG-A的转换,刚好造成T790M的突变类型出现。虽然以往报道过福尔马林造成的假阳性体细胞突变可通过对原始DNA样本的重复测序予以确定;但本文发现重复分析并不能完全区分由于FFPE标本本身引入的T790M假阳性突变。正因为如此,在使用FFPE标本分析时需充分注意假阳性干扰。

 

另一方面,为了在一定程度降低FFPE标本的假阳性,建议检测方法在材料中的适宜性有必要前期进行验证,至少一部分的结果应在可替代的方法中予以验证;而且重复分析的均值可考虑用于降低高灵敏方法造成的影响。

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